皮肤真菌的培养和正确读片是具有挑战性的。知道如何最好地收集样本、筛选、培育培养基、识别培养基的改变和真菌菌落形态可以避免误诊。
样本采集
拔毛
采集皮肤真菌培养标本，可以用无菌止血钳在新形成或皮肤病变扩张区域边缘拔取毛发，避开最近用药的区域。结痂处和头发出现损坏、残缺的地方是理想的采样点。
Mackenzie刷毛法
图1Mackenzie刷毛法用来收集皮肤真菌培养标本
图2将刷毛轻轻地在培养基表面按压
拔毛有可能错过感染的毛发而且不能充分代表感染的上皮细胞，所以最理想的样品采集方法就是Mackenzie刷毛法。运用这种方法，取出一个新的牙刷，轻轻刷过可疑区域，包括皮肤和头发，无毛或有鳞的病灶边缘（图1）。先刷未受影响的区域，然后刷病变区以避免将孢子传播到未受影响的地区，并且避免失去病变区域的孢子。然后把刷毛轻轻地嵌入真菌培养基（图2），注意不要插入太深，这有可能在拔出刷毛的时候带走培养基。用无菌止血钳清除夹在刷毛中的头发和鳞片，并将样品放在培养基表面。
Mackenzie刷毛法有助于从疑似携带者和接受抗真菌治疗痊愈的动物上获得样本。在这种情况下，用刷子刷过整个身体，特别是身体前部的病变区域，对于猫主要是脸、耳朵、爪子。建议刷一分钟或刷毛长度为动物体长的10倍。正在接受抗真菌治疗的动物，每两到三周培养一次，并继续治疗，直到获得两次阴性结果。
在疑似甲癣的情况下，这个刷子可以用于爪缝。此外，爪缝毛皮样品可以用无菌止血钳取样，感染的指甲可以用刀片刮取角蛋白碎片（采样前用酒精清洗指甲可以减少累积的腐生真菌或环境中的真菌）。如果要用撕裂的爪子进行真菌培养，弃掉远端部分，刮取身体近端的凹面进行采样。
牙刷可以使用一次就丢弃，也可以经气体消毒后重复使用。
选择和配制培养基
皮肤真菌培养基包含沙氏葡萄糖琼脂，放线菌酮、庆大霉素、金霉素作为抗菌剂来抑制污染菌的生长，添加了苯酚红作为pH指示剂。
皮肤癣菌最先代谢培养基中的蛋白，释放碱性代谢产物导致黄色培养基变红，也就是癣菌菌落出现的时候。而大多数其他种类真菌利用碳水化合物产生酸性代谢产物；当然这些腐生真菌最终也分解蛋白引起培养基的颜色变化，但这已经是真菌生长后的若干天。日常观察和记录真菌生长及培养基颜色变化对于正确解读培养结果很重要。
建议用培养皿而不是试管进行培养，试管口太窄导致牙刷头难以接种，且不便于显微镜观察真菌菌落。为了促进真菌孢子的生长和识别，可以使用皮肤癣菌试验培养基，有一个单独的沙氏琼脂或快速孢子培养基区，其中不含抑制剂。例如，在Dermatoplate-Duo（vetlab供应）培养皿的一侧有皮肤真菌试验培养基，另一侧有促孢子生长琼脂。
根据真菌培养基制造商的建议，培养基在接种之前于2-25℃避光保存。在接种时，培养皿应恢复室温（25-30℃）。在接种前和接种过程中，培养皿要按规定拿取，让培养基尽量少地暴露在环境中。不要使用过期的或者干燥、开裂、变色、微生物污染、或有其他恶化迹象的平板。过度冷凝可能会在极端温度下损坏平板。
真菌培养应在湿度为30%的室温下培养（25-30℃）。如果室温达不到要求，可以用恒温箱，或把样品寄到其他实验室进行培养。
大多数生物将在7至10天内出现，但是，平板应保存21天，尤其是最初未观察到真菌，或者样本为接受抗真菌治疗病例中取得。根据真菌培养基制造商，皮肤真菌培养平板可以在光线下培养，但有些人建议避光培养，这可以避免紫外光抑制真菌生长。在干燥环境下，建议平板放置在塑料袋或容器中，以防止基质脱水而抑制微生物生长。48至72小时后，开始每天检查平板培养基的颜色变化和真菌生长。
识别皮肤真菌
首先，最重要的是肉眼观察真菌菌落形态以确定皮肤真菌的存在。犬小孢子菌和毛癣菌属是犬猫最常见的皮肤真菌，为白色、淡黄色、棕色、或浅黄色粉状的絮状菌落（图3和图4）。皮肤真菌菌落从不显示黑色、绿色或灰色。
图3长有犬小孢子菌的皮肤真菌培养基（上部的白色至淡黄色真菌菌落），在平板底部有过度生长的灰色腐生真菌菌落。真菌培养注意观察有无可疑皮肤真菌菌落，将可疑菌落重新接种，这可以剔除腐生菌盖过皮肤真菌而导致的假阴性结果。
图4须毛癣菌培养往往产生表面粉状的白色至奶油色菌落。由于培养基培养时湿度不足，右侧培养基产生裂缝。
此外，皮肤真菌培养结果阳性，肉眼可见的菌落数提示感染严重程度，同时也是接受抗真菌治疗动物的效果反馈。
疑似菌落的显微镜检查也很重要，有些环境真菌菌落形态和使培养基变色的能力与皮肤真菌一致，而且有些犬小孢子菌的菌株不能使培养基变色。显微镜检查可在门诊完成，或把整个培养基送到专业实验室进行真菌鉴定。
显微鉴定过程
由于癣菌病是人畜共患病，在操作过程中要戴上手套，避免皮肤真菌孢子感染。用一小块干净的醋酸纤维胶带轻触真菌菌落表面，然后涂在载玻片上的蓝色液滴中（亚甲基蓝、乳酸酚棉蓝或蓝色Diff-Quik染液[嗜碱性噻嗪类染料]）（图5）。倍至倍放大检查涂片，识别皮肤真菌分生孢子的特征。
图5获得显微镜真菌鉴定的样本，用胶带轻触真菌菌落的表面，然后仔细地粘到载玻片上。
在生长初期，只能看到真菌菌丝而看不到孢子，特别是毛癣菌属。继续培养让孢子生长以便进行更加可信的鉴定。
显微镜下皮肤真菌的特点
犬小孢子菌孢子较大，呈纺锤形，厚壁，有六个或更多的子孢子（图6），通常末端有一个球状物。如果已经确定是犬小孢子菌，那么在家庭中的其他动物也要通过皮肤真菌培养来确定他们是否是携带者。所有阳性携带者都进行局部抗真菌治疗，或全身治疗。如果可以的话，隔离阳性携带者和其他未感染动物。
石膏样小孢子菌产生大的纺锤形孢子，薄壁，无末端球状物，和少于六个子孢子（图7）。
须毛癣菌产生长雪茄形的分生孢子，壁薄（图8）。螺旋状的菌丝和小葡萄簇状集群是毛真菌物种的特征（图9）。
腐生寄生性真菌会产生菌丝和小孢子，但没有分生孢子。
如果临床上很难辨认出真菌种类，建议将培养结果送检第三方实验室。
图6犬小孢子菌大分生孢子和菌丝（Diff-Quik，X）
图7石膏样小孢子菌有许多大型分生孢子，薄壁，没有末端球体，子孢子比犬小孢子菌少（Diff-Quik，X）。
图8须毛癣菌的特点是雪茄形分生孢子，数量少，但有很多球状小分生孢子（Diff-Quik，X）
图9螺旋状菌丝通常是须毛癣菌的特点（Diff-Quik，X）
总结
伴侣动物的皮肤真菌病诊断具有挑战性。然而，通过不断总结和实验，独立进行皮肤真菌培养会逐渐提供成功率，从而减少送检第三方实验室的需求。
如果在诊所内不具备真菌培养、鉴定的一系列条件，可将疑似病例的表面皮肤鳞屑和毛发样本（放在红帽无菌收集管中）送到专业实验室进行真菌培养，从而避免误诊。很多兽医皮肤科专家都采用送检第三方实验室以降低皮肤真菌培养假阴性或假阳性的几率。
KimberlyS.Coyner,DVM,DACVD，DermatologyClinicforAnimalsofLasVegas
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